Многие методы исследования в области молекулярной биологии требуют миллионов идентичных копий чистой ДНК. Полимеразная цепная реакция — это молекулярный метод, имитирующий процесс репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты для амплификации определенных сегментов ДНК in vitro. Реакция повторяется через серию изменений температуры, во время которых нити ДНК разделяются, праймеры связываются и образуются комплементарные нити.
Содержание статьи
Эволюция ДНК-полимераз
Прогресс в ПЦР был бы невозможен без эволюции ДНК-полимераз — специализированных ферментов.
История современной ПЦР началась в 1976 году с выделения ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Выявление бактерии означало, что у молекулярных биологов появился термостабильный фермент, способный к повторному циклу ПЦР без необходимости добавления свежей ДНК-полимеразы после каждого цикла.
Однако влияние, которое фермент Taq окажет на молекулярную биологию, не был ясен до 1988 года, пока фермент не коммерциализировали для широкого использования. ДНК-полимераза Taq имела мгновенный успех, и в 1989 г. даже была названа журналом Science «Молекулой года».
Хотя эти разработки представляли собой значительный прогресс, ДНК-полимераза Taq не была идеальной. Анализ с ее использованием был нестабилен при высоких температурах и подвержен ошибкам. Эти факторы сыграли роль в задержке развития возможностей ПЦР на раннем этапе, особенно в приложениях, требующих высокой специфичности и надежности. Вскоре стало очевидно, что разработка ДНК-полимераз неразрывно связана с эффективным использованием ПЦР, и что для увеличения мощности ПЦР и открытия более широкого спектра возможностей анализа необходимо разработать более совершенные ДНК-полимеразы.
В конце 1980-х годов появился ряд методов с использованием «горячего старта», помогающих преодолеть неэффективность и низкую специфичность ДНК-полимеразы Taq при высоких температурах. Эти методы заключались в нагревании образцов до 95°C и последующем охлаждении до 60–70°C перед добавлением полимеразы. Несмотря на эффективность, методы горячего старта отнимали много времени и часто вызывали перекрестное загрязнение проб. ПЦР требовалось долгосрочное решение.
В 1991 г. были выделены и разработаны полимеразы Pfu, полученные из гипертермофильных архей Pyrococcus furiosus. ДНК-полимераза Pfu, в отличие от ДНК-полимеразы Taq, имеет встроенную корректирующую активность экзонуклеазы от 3 ‘до 5’, что означает, что она может исправлять ошибки включения нуклеотидов, значительно снижать частоту ошибок и обеспечивать повышенную специфичность. Разработка и использование как полимераз Pfu, так и Taq продолжались в течение некоторого времени, при этом ПЦР сыграла важную роль в ряде новаторских исследований, таких как секвенирование.
Внедрение слитых ДНК-полимераз в 2003 году, стало первым шагом в разработке полимераз нового поколения и ПЦР высокой точности. Эти специально сконструированные ДНК-полимеразы могли преодолеть или уменьшить многие проблемы, все еще ограничивающие развитие ПЦР. Созданные путем слияния основных компонентов архебактериальной полимеразы с термостабильным ДНК-связывающим доменом, первые ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity обладали сильной корректирующей способностью и были невероятно стабильны при высоких температурах реакции. Кроме того, при использовании специализированного ДНК-связывающего домена сродство полимеразы к двухцепочечной ДНК увеличивалось в геометрической прогрессии.
Разработка полимераз следующего поколения наряду с развитием технологий ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР гарантировала, что ПЦР будет играть важную роль в будущих исследованиях в области наук о жизни и здравоохранении.
Что такое полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Он состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), составляющей генетический код человека, а также животных и растений.
В медицине анализ используется для уточнения наследственных заболеваний и генетических проблем (риск заболевания, тест на отцовство и т. д.), а также для диагностики многих инфекционных заболеваний. В отличие от серологической диагностики (определение антител к возбудителям в крови) способы полимеразной цепной реакции представляют собой прямой лабораторно-медицинский метод выявления в рамках уточнения инфекционных заболеваний.
Преимущество этого способа диагностики — быстрая доступность результатов. Кроме того, методы полимеразной цепной реакции обладают очень высокой чувствительностью. Это означает, что даже минимальное количество генетического материала от возбудителя (бактерии, вирусы и т. д.) приводит к достоверно положительному результату при наличии соответствующего патогена в нужном исследуемом материале.
Кровь — основной исследуемый материал для этого метода, однако используются и другие биологические жидкости (мокрота, моча, ликвор и т. д.). В основе генетического материала лежит особая длинноцепочечная молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.
У людей генетический материал, состоящий из двухцепочечной ДНК (две комплементарные нити), находится в ядре всех клеток организма, при этом они имеют идентичный генетический материал. Кроме того, индивидуальный геном каждого человека уникален по своему точному составу и сравним с отпечатком пальца, также уникального для каждого человека.
По этой причине генетический материал также называют «генетический код». В этой форме закодирована схема всех структур человеческого организма, таким образом она сохраняется и в дальнейшем может передаваться по наследству.
В ядрах клеток тела дезоксирибонуклеиновая кислота присутствует в особом порядке, известном как хромосомы (наследственные клетки). У людей они всегда встречаются парами, причём, одна наследуется от матери, а другая — от отца. Все клетки человеческого тела содержат в общей сложности 46 хромосом — 22 пары, называемые аутосомами, и одну пару, называемую половыми хромосомами.
Лабораторная процедура может быть использована для исследования тонкой структуры генетического кода человека, что важно при диагностике заболеваний или уточнении конкретных вопросов:
- выявление наследственных заболеваний;
- оценка риска заболевания;
- исследование врожденных особенностей обмена веществ;
- судебно-медицинская (так называемая «криминалистическая») экспертиза.
Не только люди, но и фактически все формы жизни на Земле имеют определенный генетический материал:
- грибы;
- бактерии;
- вирусы;
- паразиты и др.
Геном этих форм жизни также состоит в основном из ДНК или, в варианте некоторых вирусов, также из РНК (рибонуклеиновая кислота), которая, в отличие от ДНК — одноцепочечная. Поэтому в медицинской диагностике этот метод также проводится для уточнения многих инфекционных заболеваний:
- бактериальные инфекции, например, туберкулез, бактериальные венерические заболевания;
- вирусные инфекции, например, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция;
- паразитарные инфекции, например, малярия, и многое другое.
Компоненты полимеразной цепной реакции
ПЦР включает следующие компоненты:
- ДНК-матрица (образец дезоксирибонуклеиновой кислоты, с целевой последовательностью для амплификации);
- дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
- буфер;
- праймеры (прямые и обратные) – короткий сегмент нуклеотидов, комплементарный участку ДНК или РНК, необходимый для амплификации. В этой методике используются две короткие последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, предназначенные для связывания с началом (прямой праймер) и концом (обратный праймер) последовательности – мишени.
- Taq-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus, сопротивляющаяся инактивации при температурах денатурации и позволяющая удлинять праймеры при высокой температуре.
Этапы полимеразной цепной реакции
Для проведения лабораторного исследования, извлеченный образец (содержащий шаблон ДНК-мишени) добавляют в пробирку, содержащую праймеры, свободные нуклеотиды (dNTP) и полимеразу Taq. Смесь помещают в лабораторное оборудование (термоциклер, ДНК-амплификатор) для проведения анализа. Термоциклер увеличивает и уменьшает температуру смеси для соответствующего анализа автоматическими запрограммированными шагами, экспоненциально генерирующими копии целевой последовательности.
Полимеразная цепная реакция включает три основных этапа:
- Денатурация (разделение цепей). Разделение двух комплементарных цепей ДНК, связанных водородными связями, на пару одноцепочечных полинуклеотидных молекул в процессе нагревания (от 94C до 96C);
- Отжиг (связывающий праймеры). Понижение температуры (45-60 C), для прикрепления праймеров к одноцепочечным цепям ДНК;
- Удлинение (синтез новой ДНК). Начинается с отожженного праймера и проходит вдоль цепи ДНК (72C).
После завершения первого цикла процесс повторяется, возвращаясь к первичной температуре, и начинается следующий цикл денатурации, отжига и удлинения (автоматического процесса в термоциклере). Этому трехступенчатому температурному циклу предстоит повторяться около тридцати раз, что приведет к экспоненциальной амплификации последовательности целевого гена.
Поскольку этапы с первого по третий повторяются в несколько циклов, с каждым из них образуются вновь выстроенные цепи ДНК, отсюда и название этой лабораторной процедуры.
Анализ новообразованных цепочек ДНК
В конце, по завершении циклов цепной реакции, так называемые продукты ПЦР-анализа, то есть новообразованные молекулы ДНК, исследуют и оценивают качественно и количественно. Есть много вариантов этой оценки, в основном основанные на окрашивании (как правило, флуоресцентным красителем) ДНК и визуализации (с помощью гель-электрофореза или фотометрического флуоресцентного обнаружения).
Какие результаты анализов дает ПЦР
Результаты современных методов лабораторного исследования можно объединить в две группы:
- качественные результаты;
- количественные результаты.
Качественная методика выявляет, присутствует ли определенный участок генетического материала в исследуемом материале («положительный» результат) или нет («отрицательный» результат).
Таким образом, качественная ПЦР в основном используется для уточнения следующих диагностических вопросов (результаты «да/нет»):
- диагностика наследственных заболеваний;
- уточнение мутаций;
- распознавание генетических характеристик (например, предрасположенность к определенным заболеваниям) и т.д.
Количественная ПЦР — дальнейшее развитие лабораторной процедуры. С помощью нее выявляется не только наличие определенного участка генетического материала, но и количество генетического материала. Соответственно, количественная ПЦР используется для определения количества возбудителей в организме больного. При вирусных инфекциях эта процедура используется для выявления вирусной нагрузки.
Кроме того, количественная лабораторная оценка также имеет большое значение в фундаментальных исследованиях, благодаря чему эта диагностика приносит пользу не только медицине человека, но и ряду других научных областей: ветеринарии, биохимии, биологии и многим другим.
Преимущество этого анализа в диагностике инфекционных заболеваний состоит в том, что результаты лабораторной процедуры становятся доступны достаточно быстро (как правило, в течение одного рабочего дня). Кроме того, это тестирование считается высокочувствительным лабораторным методом. Это означает, что даже минимальное количество бактерий или вирусов в исследуемом материале приводит к достоверно положительному результату.
Наиболее важные области применения ПЦР
Что касается областей применения в области медицины человека, то этот лабораторный тест используется для решения следующих диагностических вопросов:
- Выявление наследственных заболеваний. Процедуры проводятся для диагностики большого количества наследственных заболеваний;
- Фармакогенетика. Исследуя генетические особенности метаболизма печени, можно сделать выводы об эффективности и дозировке препаратов.
- Онкологические заболевания. Метод используется, с одной стороны, для уточнения факторов риска некоторых опухолевых заболеваний (например, рака молочной железы). Однако, с другой стороны, клетки и ткани в уже возникших опухолях также можно исследовать на предмет различных мутаций, что играет все более важную роль в лечении этих заболеваний.
- Судебная медицина («судебная экспертиза»). В этом случае применение ПЦР тестирования имеет большое значение, например, в процедурах установления отцовства.
- Инфекционная медицина. ПЦР имеет огромное значение в диагностике и мониторинге течения и терапии бактериальных, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.
- Секвенирование ДНК. Это процесс определения последовательности нуклеотидов (пар оснований) определенной последовательности ДНК. Клинически секвенирование используется для выявления патогенных мутаций у лиц с генетическими нарушениями, вызванными редкими вариантами в определенном локусе. Примером может служить повторное секвенирование локуса BRCA1 у лиц с риском семейного рака молочной железы. Текущее клиническое секвенирование основано на ПЦР, при этом каждый анализ фокусируется на определенном экзоне или области гена.
- Обнаружение редких последовательностей. Технология также позволяет обнаруживать редкие последовательности в популяции молекул ДНК или РНК. Это особенно полезно при поиске перестроек ДНК в условиях неоплазии. Примером может служить открытие того, что вирус, родственный Herpes simplex, участвует в патогенезе саркомы Капоши.
Продолжение статьи
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 1.
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 2.
