Цитогенетические аномалии — это генетические дефекты, затрагивающие большие участки хромосом, а не маленькие фрагменты ДНК (например, транслокации, большие делеции или анеуплоидии). Эти дефекты могут быть обнаружены по меньшей мере тремя методами – хромосомным (кариотипическим) анализом, флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с использованием специфических ДНК-зондов либо на метафазных хромосомах, либо на межфазных ядрах и сравнительной геномной гибридизацией массива (aCGH). Последние два метода считаются “молекулярной цитогенетикой”, поскольку они могут обнаруживать аномалии, которые ниже разрешения хромосомного анализа.
Содержание статьи
Хромосомный анализ
Хромосомный анализ (также называемый бэндингом хромосом) используется для обнаружения изменений в больших участках хромосом (транслокаций, крупных делеций или анеуплоидий).
Для проведения хромосомного анализа лимфоциты, обычно полученные из периферической крови, культивируют in vitro и стимулируют к делению под действием митогенов. Также могут быть проанализированы, часто без митогенного стимула, другие типы клеток: амниоциты, клетки костного мозга, фибробласты и опухолевые клетки. Как только клетки легко делятся, добавляется химическое вещество для остановки митотического деления в метафазе. В этой фазе клеточного цикла хромосомы максимально сжаты, и, следовательно, их полосы легче распознать.
Для идентификации каждой отдельной хромосомы используется хромосомное бэндирование, необходимое для оценки того, присутствует ли правильное количество каждой хромосомы (две из каждой аутосомы плюс половые хромосомы) и имеются ли структурные аномалии. Эта техника может быть выполнена с использованием различных ферментов и красителей. Наиболее часто используемый метод полос — GTG (G-полоса с трипсином и полоса Гимзы). Идентичный образец полос наблюдается при Q-полосовании, при котором хромосомы окрашиваются флуоресцентным красителем и просматриваются в ультрафиолетовом свете.
Типичное разрешение бэндинга хромосом составляет около 400 полос в гаплоидном наборе из 23 хромосом. Одна полоса хромосом может содержать 6 мегабаз (Mb) ДНК и примерно 150 генов. Если требуется более высокое разрешение полос для изучения относительно небольших хромосомных перестроек, клеточные циклы могут быть синхронизированы, и клетки могут быть остановлены в прометафазе (550 полос) или даже профазе (приблизительно 800 полос). Последний метод называется полосованием с высоким разрешением.
Примеры использования этого метода включают оценку пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).
Преимущества хромосомного бэндинга:
- В отличие от молекулярно-генетических исследований, методы группирования хромосом показывают весь геном за один раз;
- Этот метод подходит в диагностических ситуациях, когда подозревается специфическая аномалия (например, Филадельфийская хромосома при хроническом миелоидном лейкозе). Это также может быть полезно для мониторинга заболевания, например, для выявления дополнительных хромосомных аномалий, обычно наблюдаемых при прогрессировании хронического миелоидного лейкоза;
- При заболеваниях, имеющих делеции различного размера в пределах определенной хромосомы, таких как множественная миелома, можно сравнить кариотипы многих пациентов, чтобы найти критическую область, ассоциированную с заболеванием.
Недостаток: большинство методов кольцевания хромосом позволяют обнаружить только основные структурные аномалии и не обнаруживают увеличения или потери меньших участков ДНК.
Флуоресцентная гибридизация in situ
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод, позволяющий подсчитывать количество и расположение крупных фрагментов хромосом. Этот метод значительно повысил чувствительность, специфичность и разрешение хромосомных анализов. FISH можно проводить на метафазных хромосомах или интерфазных ядрах; интерфазную FISH можно проводить на ткани, залитой в парафин.
Метафазная флуоресцентная гибридизация in situ позволяет идентифицировать крупные хромосомные аномалии, включая делеции, дупликации и транслокации, а также более мелкие хромосомные микроделеции и дупликации. Для метафазной FISH клетки останавливаются в митозе, как и для хромосомного связывания. Затем их фиксируют смесью уксусной кислоты и метанола, а затем «капают» на предметное стекло микроскопа, где они прикрепляются. Используются ДНК-зонды длиной в несколько сотен килобаз (кб), которые соответствуют участкам хромосом, содержащим рассматриваемую последовательность ДНК. Эти зонды непосредственно гибридизуются с хромосомами на предметном стекле (отсюда и термин «гибридизация in situ»). Немедленное обнаружение флуоресцентного сигнала возможно с помощью флуоресцентной микроскопии. Также доступны менее широко используемые методы изотопной и неизотопной химической маркировки.
Зонды FISH производят флуоресцентную точку на хромосоме, с которой они гибридизуются. Таким образом, каждая пара хромосом (или хромосомных участков) дает две точки. Эти двойные точки иногда сливаются, образуя один сигнал. Клетки, являющиеся моносомными для рассматриваемой хромосомной области, будут показывать только одну точку на ядро, в то время как трисомные клетки будут показывать три точки.
Флуоресцентную гибридизацию in situ также можно модифицировать для анализа интерфазных ядер.
Преимущества этого метода:
- Разрешение FISH намного лучше, чем у традиционных хромосомных полос (FISH может разрешать 2 мегабазы (Мб) в длину, по сравнению с 6 Мб для хромосомных полос);
- Флуоресцентную гибридизацию in situ можно применять как к делящимся (метафазным), так и к неделящимся (интерфазным) клеткам;
- Технически протокол довольно прост;
- Гибридизация с несколькими зондами позволяет обнаруживать продукты транслокации. Примером может быть слияние BCR-ABL1 t(9;22) при хроническом миелоидном лейкозе;
- FISH может идентифицировать ряд структурных аномалий, включая делеции, дупликации, анеуплоидию и наличие производных (структурно перестроенных) хромосом;
- Флуоресцентная гибридизация in situ может использоваться для мониторинга рецидивов или остаточных заболеваний у пациентов с трансплантацией костного мозга.
Недостатки метода:
- Не могут быть идентифицированы небольшие мутации, включая небольшие делеции и вставки, а также точечные мутации;
- Однородительская дисомия (наследование обеих копий хромосомы от одного и того же родителя) будет пропущена, поскольку зонд просто обнаруживает наличие или отсутствие локуса, или определенной части хромосомы, а не ее источник;
- Хромосомные инверсии будут пропущены, поскольку зонд может обнаружить только наличие определенной последовательности, но не ее точное местоположение в хромосоме.
Интерфазная FISH (флуоресцентная гибридизация in situ)
Интерфазная флуоресцентная гибридизация in situ используется, когда делящиеся клетки недоступны (например, в полностью дифференцированных клетках или в тканях, которые были зафиксированы и залиты парафином). Это также улучшает разрешение зондов FISH.
Для интерфазной FISH клетки тестируют с помощью FISH-зондов без синхронизации клеточного цикла. При использовании интактных ядер (например, не из ткани, залитой парафином) клетки собирают с помощью гипотонического раствора, фиксируют и снова «капают» на предметные стекла. Для FISH на тканях, залитых в парафин, делают тонкие срезы патологических образцов и прикрепляют к предметным стеклам.
Поскольку хромосомы лишь минимально конденсируются в интерфазе, эта модификация анализа FISH предоставляет возможность гибридизировать зонды с высоким разрешением (значительно меньше 1 Мб, по сравнению с 2 Мб для метафазного анализа FISH).
В интерфазном ядре невозможно различить хромосомные структуры и будет светиться только гибридизированный зонд. Гибридизация с двумя разными цветовыми зондами, пересекающими области точек разрыва генов, участвующих в транслокации, приводит к ожидаемым сигналам от нормальной хромосомы, а также к сигналу слияния от производной хромосомы (хромосом), на которой гены сопоставляются в результате транслокации.
Преимущества интерфазной FISH включают более высокое разрешение, чем метафазная FISH. Имеется возможность проведения теста сразу, без культивирования клеток, что делает его более быстрым. Интерфазная FISH имеет особое значение в пренатальной диагностике различных состояний анеуплоидии, таких как трисомия 18 или трисомия 21, при которых возможность быстрого получения результатов помогает в принятии решения.
Основным недостатком интерфазы по сравнению с метафазной FISH считается то, что при интерфазной FISH невозможно визуализировать сами хромосомы. Таким образом, невозможно предоставить информацию об общем количестве и составе хромосом.
Спектральное кариотипирование
Спектральное кариотипирование (SKY, также называемое многоцветным FISH) — это метод FISH, точно определяющий хромосомное происхождение всех элементов в кариограмме (полный набор хромосом) с использованием нескольких длин волн света для генерации сигналов многих цветов. Комбинацию из пяти флуорохромов можно использовать в качестве зондов, чтобы «окрасить» все 22 аутосомы, а также X- и Y-хромосомы в разные цвета. Кариограмма анализируется с помощью компьютеризированного спектрального устройства формирования изображений, и хромосомы классифицируются на основе их конкретных спектров излучения.
Преимущества этой техники:
- Этот метод позволяет провести полное кариотипирование с помощью автоматизированного анализа;
- О происхождении маркерных хромосом, небольших вставок и сложных перестроек можно судить по наличию хромосомных сегментов с цветовой кодировкой.
Недостатки:
- Несмотря на то, что часть анализа компьютеризирована, общая методика достаточно трудоемкая;
- Структурные перестройки в пределах одной хромосомы не будут обнаружены;
- Разрешение SKY относительно низкое (до 15 Мб);
- Спектральное кариотипирование можно использовать при подозрении на определенную аномалию, но его нельзя применять в качестве метода скрининга.
Сравнительная геномная гибридизация
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) позволяет обнаруживать амплификации и делеции небольших участков ДНК по длине всех хромосом. Этот метод работает путем сравнения геномного содержимого (или ДНК) пациента (или мишени) с нормальным контрольным индивидуумом (или индивидуумами). Разрешение «классического» или метафазного CGH относительно низкое (примерно 15 Мб ДНК).
Массив CGH представляет собой модификацию сравнительной геномной гибридизации, в которой ДНК, РНК или ткань сравнения располагаются на предметном стекле или стеклянных шариках. Существует три основных типа массивов: массивы бактериальных искусственных хромосом (ВАС), массивы олигонуклеотидов (обычно длиной 60 пар оснований) или массивы однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (обычно несколько нуклеотидов). Большинство массивов на основе SNP также включают зонды с одним локусом, а также SNP.
Существует как минимум два разных типа массивов: «целевые» массивы и массивы целых геномов.
- Целевые массивы. «Нацеливаются» на известные синдромы микроделеций/микродупликаций, а также на другие известные локусы наследственных менделевских расстройств (например, туберозный склероз). Первыми целевыми массивами были массивы от 500 до 600 BAC.
- Полногеномные массивы. Охватывают весь геном с разным уровнем разрешения. Первые полные геномные массивы представляли собой массивы BAC с примерно 2600 BAC, разнесенными примерно на 1 Мб по всему геному (т. е. с разрешением примерно 1 Мб). Массивы олигонуклеотидов и SNP заменили использование BAC. Большинство лабораторий используют массивы олигонуклеотидов или SNP со средним разрешением около 35 кб по всему геному.
Массивы как SNP, так и олигонуклеотидов могут обнаруживать вариации числа копий, но только массивы SNP можно использовать для определения отсутствия или потери гетерозиготности (AOH или LOH) для различных областей или даже целых хромосом при наличии нормального числа копий. AOH относится к наследованию только отцовских или материнских аллелей. Отсутствие наследования от двух родителей можно увидеть при одноплодной дисомии (UPD) или в некоторых образцах раковой ткани.
Одноплодная дисомия может быть результатом гетеродисомии, при которой присутствуют две разные гомологичные хромосомы от одного и того же родителя (либо по материнской, либо по отцовской линии) вместо нормального вклада двух родителей (по одной хромосоме от каждого родителя). Альтернативно, одноплодная дисомия может возникать при наличии двух идентичных копий одной родительской хромосомы (изодисомия). SNP-массивы могут обнаруживать только UPD, вторичные по отношению к изодисомиям.
Интерпретация массива CGH также может быть осложнена присутствием вариантов числа копий (CNVs), которые могут быть доброкачественными, патогенными или неизвестными.
Преимущества массива CGH:
- Обычно делящиеся клетки и тканевые культуры не нужны; метод требует только хорошей, высококачественной ДНК;
- Разрешение массива зависит от типа используемого массива и среднего расстояния между «зондами» на массиве;
Недостатками этой техники считаются:
- Сбалансированные структурные перестройки (т. е. сбалансированные транслокации, инверсии, вставки) не будут обнаружены, поскольку количество копий не изменится;
- Уровни мозаичности (т.е. изменения количества копий в некоторых, но не во всех ячейках) в 20 процентов или менее не будут обнаружены;
- Интерпретация изменений количества копий, о которых ранее не сообщалось, может быть сложной задачей, особенно если фенотипически нормальный родитель несет такое же изменение.
Продолжение статьи
- Современные методы диагностики: молекулярная генетика и цитогенетика. Обнаружение известных мутаций.
- Обнаружение цитогенетических аномалий.
- Генотипирование новых мутаций.
