Современные методы диагностики: молекулярная генетика и цитогенетика

Современные исследования экспоненциально расширили знания о генетическом коде людей и других организмов, что привело к разработке различных технологий, облегчающих понимание нормальных и аномальных генетических процессов. Многие из этих методов в настоящее время регулярно используются в молекулярной диагностике наследственных нарушений и заболеваний, возникающих в результате соматических мутаций (гематологические злокачественные новообразования).

Молекулярно-генетическая и цитогенетическая диагностика — бесценное дополнение к клинической оценке, предоставляющее диагностическую, терапевтическую и прогностическую информацию.

Для чего применяются цитогенетические и молекулярные диагностические инструменты

В клинической генетике цитогенетические и молекулярные варианты исследований применяются для трех основных целей: 

• Обнаружение специфических мутаций. Обнаружение мутаций известных изменений последовательности — этот тип тестирования относится к целенаправленным и обычно ограничивается заранее определенным количеством изменений последовательности. Отбор, как правило, основан на ассоциации с клиническими фенотипами. Изменения последовательности могут быть локализованы внутри одного гена или между несколькими генами. В зависимости от используемого метода тестирования количество включенных изменений последовательности может варьироваться от одной до тысяч мутаций.
• Изучение крупных вариантов хромосомной структуры. Цитогенетические исследования крупных структурных вариантов обычно проводятся, когда фенотип не ограничивается точечными мутациями и относительно небольшими делециями и дупликациями. Такие исследования полезны при изучении синдромных фенотипов и совокупности симптомов, обычно связанных с аномалиями в масштабе хромосом, а не отдельных экзонов или генов.
• Генотипирование для поиска ранее не идентифицированных мутаций. Методы генотипирования могут быть применены для выявления мутаций, которые не были выбраны заранее. Эти методы направлены на обнаружение мутаций и могут быть нацелены на ген с известным гетерогенным распределением мутаций или направлены на более крупные сегменты генома для выявления известных или новых вариаций.

Обнаружение известных мутаций

Существует множество различных подходов для идентификации выбранных известных мутаций. Как правило, они начинаются с полимеразной цепной реакции, после которой выполняются дополнительные этапы анализа. Для идентификации известных аномалий также могут быть применены общие методы обнаружения мутаций, например, секвенирование ДНК. 

Полимеразная цепная реакция

Автоматическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) — первый этап в подавляющем большинстве анализов ДНК, поскольку она увеличивает количество ДНК, доступной для анализа.

Расщепление ферментом рестрикции

Метод может быть использован для обнаружения мутаций, создающих или разрушающих сайт фермента рестрикции. Специфические ферменты рестрикции, обычно выделяемые из бактерий, распознают уникальные короткие последовательности внутри фрагмента ДНК. Эти ферменты могут расщеплять нити ДНК именно в этом месте. Если мутация либо изменяет код ДНК на последовательность, создающую новый сайт фермента рестрикции, либо уничтожает существующий сайт фермента рестрикции, мутация может быть обнаружена на основе присутствия или отсутствия сайта.

Один из примеров такого теста – анализ рестрикционного переваривания при синдроме Мюнке, типе синдрома краниосиностоза, определяемом единственной мутацией (c.749C>G, p.Pro250Arg) в гене FGFR3, создающей новый сайт рестрикции. В этом анализе экзон 7 амплифицируется с помощью ПЦР, и образец подвергается рестрикционному расщеплению ферментом Ban I, распознающим новый сайт. ДНК пациентов с мутацией расщепляется ферментом, в то время как контрольная ДНК без мутации остается нерасщепленной.

Преимущества этого метода:

• Метод технически прост и может быть выполнен в течение одного дня;
• Анализ рестрикционных ферментов обнаруживает специфические мутации и может быть применен ко многим образцам одновременно. Затем эти образцы обрабатывают совместно, на одном геле.

К недостаткам можно отнести следующее:

• Этот метод нецелесообразен при заболеваниях, вызванных большим количеством различных мутаций, и для обнаружения мутаций, связанных с последовательностями нуклеотидов, требующих применения дорогостоящих рестрикционных ферментов;
• Только небольшая часть существующих точечных мутаций фактически создает или удаляет сайт рестрикции. В некоторых случаях эту проблему можно обойти путем введения искусственного сайта рестрикции во время ПЦР-амплификации;
• Неполное расщепление может привести к ошибочным результатам. Эту проблему можно преодолеть, используя адекватные средства контроля.

Система мутаций, устойчивых к амплификации

Система мутаций, устойчивых к амплификации (ARMS), может использоваться для обнаружения известных точечных мутаций. Этот метод требует проведения мультиплексной ПЦР-реакции. В этой реакции две пары праймеров добавляются в одну пробирку для ПЦР, и две отдельные последовательности из одного фрагмента ДНК амплифицируются в одной и той же реакции.

Одна реакция (с использованием контрольной пары праймеров) — внутренний контроль, демонстрирующий, что сама реакция ПЦР сработала. Другая реакция (с использованием пары праймеров, специфичных для исследуемой мутации) приведет к амплификации последовательности-мишени в зависимости от наличия или отсутствия конкретной точечной мутации.

Вторая пробирка содержит ДНК от того же пациента и включает контрольную пару праймеров и пару праймеров, амплифицирующих только нормальную последовательность. Единственным различием между праймерами для нормальной и мутантной последовательности считается комплементарность одного праймера на 3 – конце, где один идентичен нормальной, а другой – вариантной последовательности. Другой праймер идентичен для обеих реакций, и размер продукта будет одинаковым. При совместном нанесении на гель эти образцы будут демонстрировать гомозиготность по нормальной последовательности, гомозиготность по мутации или гетерозиготность.

Этот анализ считается фактической модификацией самой ПЦР, а не дополнительным этапом после первоначальной амплификации. ARMS может быть выполнен только для одной или небольшого числа одновременно тестируемых мутаций. Примером может быть ARMS-тест на мутацию BRAF c.1799T>A (p.V600E), выявленную при колоректальном раке, меланоме и папиллярном раке щитовидной железы.

К преимуществам этой техники можно отнести следующее:

• Может обнаруживать определенные точечные мутации и одновременно оценивать множество образцов. 
• Модификация метода позволяет анализировать несколько мутаций в одной пробирке.

Недостатки:

• Нецелесообразно при заболеваниях, вызванных большим количеством мутаций;
• Пары праймеров должны быть разработаны для всех реакций. Обязательное условие – амплификация этих реакций в одинаковых условиях. Если условия неоптимальны для одной из пар праймеров, слабая амплификация или неспецифическая амплификация могут привести к неоднозначным результатам;
• Для каждого образца пациента требуется несколько пробирок для ПЦР.

Аллель-специфическая олигонуклеотидная гибридизация

Аллель-специфическая олигонуклеотидная гибридизация (ASO) включает размещение (“точечное выделение”) денатурированной ПЦР-амплифицированной ДНК на мембране и последующую гибридизацию с короткими аллель-специфичными мечеными зондами. При оптимальных условиях гибридизации и промывки гибридизация произойдет только в том случае, если последовательность зонда идеально комплементарна одноцепочечной ДНК образца.

Как правило, продукты ПЦР из образца одного пациента фиксируют на двух идентичных мембранах (“точечный блот”), одна из которых гибридизуется с зондом, содержащим нормальную последовательность, в то время как другая гибридизуется с зондом для мутантной последовательности. Два зонда должны отличаться всего на один нуклеотид, соответствующий исследуемой точечной мутации. 

После воздействия авторадиографической пленки в случае маркировки радиоактивного зонда или после химической обработки в случае биотинилированных олигомеров регистрируются положительные сигналы и может быть определена гетерозиготность или гомозиготность по нормальной или мутантной последовательности.

Гибридизация ASO может быть модифицирована для анализа панели мутаций у одного пациента. Например, при “обратной” аллель-специфичной гибридизации на мембрану наносятся зонды, специфичные для последовательности, и на каждого пациента используется только одна мембрана. Обратный ASO менее экономичен, чем обычный ASO, но может сократить время обработки каждого образца. Этот метод часто применяется при молекулярном тестировании на муковисцидоз.

Преимущества гибридизации ASO включают следующее:

• Подходит для анализа специфических мутаций или полиморфизмов в многочисленных образцах;
• При правильной оптимизации он обладает высокой чувствительностью и специфичностью;
• Возможна адаптация для мультиплексного ПЦР-анализа или автоматического анализа микрочипов (ДНК-чипов).

Недостатки:

• Каждый зонд ASO может обнаруживать только одну определенную последовательность;
• Гибридизация ASO возможна только при небольших мутациях ДНК;
• Существует потенциальная неспецифичность, если условия гибридизации и/или промывки не полностью оптимизированы.

Микрочипы для генотипирования

Микрочипы для генотипирования доступны на множестве различных молекулярных платформ. Все они могут опрашивать гибкое количество мутаций одновременно, что делает их привлекательными для высокопроизводительных анализов в одном или нескольких генах, для одного или многих разных пациентов одновременно. Эти анализы, как правило, автоматизированы и в условиях высокой производительности (т.е. автоматизированного анализа нескольких образцов одновременно) не требуют ручной работы после начала выполнения анализа.

Преимущества этого метода включают в себя следующее:

• Подходит для высокопроизводительного анализа специфических мутаций или полиморфизмов в многочисленных образцах;
• Для каждого образца требуется относительно меньше практической работы;
• Интерпретация данных может быть высокоавтоматизирована.

Недостатки:

• Оборудование для анализа микрочипов, а также отдельные матрицы могут быть дорогостоящими;
• Часто этот метод не подходит для тестирования в малых объемах, в частности, когда микрочипы можно использовать только один раз, независимо от того, тестируется только один образец или много образцов.

Продолжение статьи

• Современные методы диагностики: молекулярная генетика и цитогенетика. Обнаружение известных мутаций.
• Обнаружение цитогенетических аномалий.
• Генотипирование новых мутаций.