При заболеваниях с аллельной гетерогенностью найти мутацию, вызывающую заболевание, непросто. При этих расстройствах необходимо сканировать гены на наличие мутаций, прежде чем можно будет идентифицировать конкретную мутацию, вызывающую заболевание. После обнаружения и характеристики нового варианта последовательности необходимо установить его патогенность. Это обычно достигается путем скрининга большого количества нормальных контрольных особей, которые, как ожидается, не будут нести один и тот же аллельный вариант. Кроме того, следует сравнить последовательность ДНК больных и здоровых людей в одной семье.
В настоящее время доступно множество методов скрининга мутаций, но наиболее широко применяются методы, описанные ниже. Однако даже самые распространенные методы скрининга имеют ограниченное применение в клинико-диагностических лабораториях, поскольку поиск отдельных болезнетворных мутаций – трудоемкий и дорогостоящий процесс.
Содержание статьи
Гетеродуплексный анализ
Гетеродуплексный анализ используется для обнаружения точечных мутаций на одной нити спирали ДНК. Методика использует денатурацию и повторный отжиг двухцепочечной ДНК-мишени. Если комплементарные одиночные нити повторно отжигаются, они образуют идеально выровненный гомодуплекс. С другой стороны, отдельные цепи, не являющиеся полностью комплементарными из-за наличия точечной мутации в одной цепи, образуют гетеродуплекс. Отсутствие отжига во всех положениях основания приводит к образованию «пузыря» во вновь образованной двойной нити. По сравнению с обычной ДНК, ДНК с пузырьком мигрирует медленнее во время электрофореза.
Этот метод относительно прост в исполнении и требует небольшой оптимизации. Некоторые из доступных гелевых матриц менее токсичны, чем полиакриламидные гели. Недостатком считается то, что этот метод сканирования не позволяет определить местонахождение мутации в анализируемом фрагменте.
Анализ конформации одноцепочечной ДНК
Анализ конформации одноцепочечной ДНК (SSCA) основан на наблюдении, что одноцепочечные фрагменты ДНК принимают уникальные конформации, зависящие от состава их последовательностей, при прогоне в неденатурирующем полиакриламидном геле. Таким образом, миграция через гель зависит от длины цепи, а также от конформации нити. Прежде чем можно будет сделать интерпретацию, необходимо знать специфический характер миграции в контрольных образцах дикого типа. Это может быть достигнуто путем добавления обычных элементов управления в прогоне.
После оптимизации этот метод пригоден для скрининга довольно большого количества образцов за один раз. Однако этот метод сканирования не определяет локализацию мутации в анализируемом фрагменте. Анализ конформации одноцепочечной ДНК также требует оптимизации, и воспроизводимость условий во всех анализах одной и той же последовательности ДНК имеет решающее значение.
Автоматическое секвенирование
Наиболее прямой подход к обнаружению мутаций – автоматическое секвенирование. Представляющая интерес последовательность ДНК амплифицируется в присутствии праймера и терминаторов дидеоксинуклеотидной цепи. Либо праймер, либо терминаторы цепи имеют флуоресцентную маркировку. Когда последовательность подвергается электрофорезу в автоматическом секвенаторе, лазерный луч возбуждает флуоресцентные нуклеотиды, производя сигнал, который может быть скомпилирован в последовательность ДНК.
Преимущества этого метода включают точную идентификацию всех вариаций ДНК в последовательности-мишени. Метод может быть применен как для обнаружения известных и неизвестных мутаций. Для большого числа наследственных состояний продолжают обнаруживаться новые мутации, дополняющие понимание спектров мутаций и корреляций генотип-фенотип. Клиническое тестирование улучшается благодаря более комплексному, инклюзивному подходу к диагностике.
Недостатки метода включают финансовые затраты, время и возможность получения данных низкого качества из-за некачественного исходного материала.
Саузерн и нозерн-блоттинг
Саузерн-блоттинг можно использовать для выявления небольших мутаций, а также крупных делеций, дупликаций и перестроек генов, изменяющих сайты расщепления ферментом рестрикции или размеры полученных фрагментов ДНК. В этом методе геномная ДНК расщепляется одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции и переносится на мембрану. Эта мембрана гибридизуется с одноцепочечным радиоактивно меченым зондом в условиях, способствующих образованию двухцепочечных соединений между зондом и фрагментами геля, содержащими комплементарную последовательность. Когда авторадиографическая пленка подвергается воздействию мембраны и проявляется, гибридизированные последовательности становятся видимыми в виде полос. Расположение каждой из этих полос соответствует размеру фрагмента, с которым связан зонд.
Аналогичный метод может быть применен, когда РНК – основной материал. С помощью этого метода, получившего название “Нозерн-блоттинг”, можно анализировать размер, количество и характер экспрессии транскриптов генов в разных тканях.
Преимущества этих методов заключаются в возможности обнаружения широкого спектра мутаций и крупных структурных перестроек. Саузерн-блоттинг также может быть использован для выявления изменений в статусе метилирования генов (влияющих на чувствительность к расщеплению рестрикционных нуклеотидов).
Недостатки включают в себя требование большего количества ДНК, чем другие методы, упомянутые здесь, а также требования к трудозатратам и времени. Как правило, выполнение этого анализа может занять неделю. Использование радиоактивных материалов может быть дорогостоящим и опасным. Однако возможно применение нерадиоактивных методов, таких как хемилюминесценция.
