You are currently viewing Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 2
Анализ крови. Автор фото seventyfourimages

Алена Герасимова (Dalles) Разработчик сайта, редактор

Разработчик сайтов, журналист, редактор, дизайнер, программист, копирайтер. Стаж работы — 25 лет. Область интересов: новейшие технологии в медицине, медицинский web-контент, профессиональное фото, видео, web-дизайн.
  • Reading time:6 минут чтения

Для повышения полезности ПЦР были разработаны несколько модификаций лабораторных методов. Некоторые из распространенных типов ПЦР: в реальном времени (количественная или кПЦР, с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), мультиплексная, вложенная, с горячим запуском. 

ПЦР в реальном времени: принципы и методы

Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР; кПЦР) представляет собой высокочувствительный способ количественного определения абсолютного или относительного количества определенной последовательности нуклеиновой кислоты, где накопление продуктов ПЦР во времени измеряется напрямую, без пост-ПЦР-модификаций.

Количественное определение оценивается по количеству циклов, необходимых для того, чтобы реакция генерировала достаточную флуоресценцию, чтобы пересечь установленный порог. Таким образом, этот метод основан на выполнении нескольких раундов амплификации. Общие применения qPCR включают профилирование экспрессии генов, количественную оценку вирусной нагрузки и определение числа копий.

Хотя доступны различные модели лабораторных методик в реальном времени, все они имеют общие черты: стандартная платформа термоциклера в сочетании с источником возбуждения (обычно лазером или вольфрамовой лампой), камерой для обнаружения флуоресценции и компьютером, включающим программное обеспечение для обработки данных.

В зависимости от доступного источника возбуждения и фильтров при обнаружении в количественной ПЦР используются различные флуоресцентные красители. Два наиболее часто используемых способа этого анализа – SYBR green (краситель, связывающийся с двухцепочечной ДНК, и при таком связывании флуоресцирует) и зонды TaqMan соответственно.

Основные особенности ПЦР в реальном времени

И амплификация, и обнаружение продукта осуществляются в одном никогда не открывающемся реакционном сосуде. Это резко снижает вероятность перекрестного загрязнения образцов.

По сравнению с обычными ПЦР-тестами, приборы для тестирования в реальном времени не только способны измерять амплифицированный продукт (ампликон) в процессе его производства, но также способны количественно определять количество продукта и, таким образом, определять количество копий мишени в исходном образце.

Количество времени, необходимое для завершения тестирования в реальном времени, значительно меньше по сравнению с традиционными анализами на основе ПЦР, поскольку время, необходимое для обнаружения амплифицированного продукта после лабораторного исследования, исключается за счет использования флуоресцентных зондов. Кроме того, некоторые системы способны выполнять быстрое термоциклирование в зависимости от конструкции прибора, обнаруживая продукт всего за 20–30 минут.

В целом, для обычного тестирования требуется как минимум от 4 до 6 часов с момента помещения выделенной нуклеиновой кислоты в термоциклер для начала амплификации до последующего обнаружения продукта.

Принцип проведения анализа

Лабораторное исследование в реальном времени проводится так же, как и обычные тесты на основе ПЦР (денатурация двухцепочечной ДНК с последующим отжигом и удлинением праймера). Однако именно процесс обнаружения отличает лабораторную методику в реальном времени от традиционных ПЦР-анализов. Во время ПЦР – диагностики в реальном времени отслеживают накопление ампликона по мере его образования с помощью мечения праймеров красителями, способными флуоресцировать. Эти метки вызывают изменение флуоресцентного сигнала, измеренного прибором, после их прямого взаимодействия с ампликоном или гибридизации с ним. Этот сигнал связан с количеством амплифицированного продукта, присутствующего во время каждого цикла, и увеличивается по мере увеличения количества специфических ампликонов.

В настоящее время для обнаружения ампликонов используется ряд флуоресцентных химических веществ; наиболее часто используемые химические соединения можно разделить на две категории: 

  • включающие неспецифическое связывание флуоресцентного красителя (например, SYBER Green I) с двухцепочечной ДНК;
  • флуоресцентные зонды, специфически связывающиеся с нужной мишенью.

Методы обнаружения

Описан ряд вариантов лабораторной методики в реальном времени, но два из них оказались наиболее популярными.

ПЦР с использованием SYBR

SYBR green — это краситель, связывающийся с двухцепочечной ДНК, и при таком связывании флуоресцирующий. Во время цикла, по мере того как образуется все больше и больше двухцепочечных продуктов, к которым прикрепляется и флуоресцирует зеленый краситель SYBR, генерируется увеличивающееся количество флуоресцентного сигнала. Количество флуоресценции в соединении в любой конкретный момент времени напрямую связано с количеством в нем двухцепочечных молекул ДНК.

Однако недостаток SYBR green состоит в том, что он будет связывать и флуоресцировать все двухцепочечные продукты реакции, будь то специфические продукты, неспецифические продукты, димеры праймеров или другие артефакты амплификации.

Зонды TaqMan были названы в честь популярной видеоигры Pac-Man (Taq полимераза + PacMan = TaqMan), поскольку авторы заметили, что экзонуклеазная активность Taq Полимеразы имеет сходство с классической игрой Pac-Man.

ПЦР TaqMan (5’-нуклеазный анализ)

TaqMan PCR использует меченый красителем зонд нуклеиновой кислоты, комплементарный внутреннему сегменту ДНК-мишени. Этот меченый красителем зонд отжигается на одной из матричных цепей рядом с одним из двух праймеров и ниже по протоку от него. Зонд помечен двумя флуоресцентными фрагментами, репортер (флуорофор) присоединен к 5’-концу зонда, а гаситель – к его 3’-концу.

Когда репортер и гаситель соединены, гаситель уменьшает флуоресцентный сигнал репортерного красителя, поскольку он поглощает энергию посредством передачи энергии резонанса флуоресценции (FRET). Однако во время PCR Taq-полимераза, удлиняя праймер на цепи-мишени зонда, смещает и разрушает отожженный зонд за счет действия его экзонуклеазной функции с 5′ на 3′. Таким образом, флуорофор освобождается от молекулярного связывания с гасителем и флуоресцирует.

По мере образования большего количества продуктов ПЦР более меченый красителем зонд будет находить целевые области для присоединения, что в конечном итоге приводит к высвобождению репортерной молекулы во время последующего процесса амплификации. Высвобождение репортерных красителей отражается в увеличении интенсивности флуоресцентного сигнала, пропорциональному количеству синтезированного ампликона.

При использовании зондов SYBR green или TaqMan взаимосвязь между интенсивностью сигнала и количеством матрицы в реакции анализа в реальном времени обеспечивает надежность как для количественного определения нуклеиновых кислот, так и для анализа наличия или отсутствия определенных последовательностей генов.

Преимущества метода ПЦР в реальном времени

Методика в реальном времени позволяет рассчитать исходную концентрацию матрицы и является часто используемым аналитическим инструментом для оценки количества копий дезоксирибонуклеиновой кислоты, вирусной нагрузки, обнаружения SNP и аллельной дискриминации. Когда количественной ПЦР предшествует PCR с обратной транскрипцией, кПЦР становится мощным инструментом для измерения экспрессии мРНК и считается золотым стандартом для подтверждения данных об экспрессии генов на микрочипах.

К существенным преимуществам техники в реальном времени относятся:

  • способность измерять концентрации ДНК в большом диапазоне,
  • высокая чувствительность,
  • способность обрабатывать несколько образцов одновременно и предоставлять немедленную информацию.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

ПЦР с обратной транскрипцией, представляет собой разновидность PCR, как правило, измеряет уровни экспрессии РНК. В этом виде комплементарная кДНК образуется путем обратной транскрипции матриц РНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Этот вариант тестирования используют для качественного изучения экспрессии генов, и он может быть объединен с ПЦР в реальном времени (qPCR) для количественного анализа.

Фермент обратной транскриптазы транскрибирует матричную РНК и образует комплементарную ДНК (кДНК). Одноцепочечная превращается в двухцепочечную с помощью ДНК-полимеразы. Эти молекулы ДНК используются в качестве матриц для реакции PCR.

В настоящее время в одностадийной методике используют единственную термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую также значительной обратной транскриптазной активностью.

Принцип действия ПЦР с обратной транскрипцией

Обратную транскрипцию и PCR-амплификацию проводят как двухэтапный процесс используя одну пробирку или при помощи двух отдельных реакций. В обоих вариантах РНК вначале подвергается обратной транскрипции в комплементарной ДНК, и затем используется в качестве матрицы для ПЦР-амплификации.

Праймеры, которые используют для синтеза кДНК, могут быть либо не специфичными к последовательности праймеров (смесь случайных гексамеров или primer oligo-dT), либо специфичными к последовательности праймерами.

Праймеры, не специфичные для последовательности:

  • Случайные гексамеры. Представляют собой смесь всех возможных комбинаций шести нуклеотидных последовательностей, случайным образом присоединяющихся к мРНК и инициирующих обратную транскрипцию всего пула РНК.
  • Primer Oligo-dT. Комплементарны поли-А хвосту молекул мРНК и позволяют синтезировать комплементарную ДНК только из молекул мРНК.

Специфичные для последовательности праймеры предназначены для селективного связывания с интересующими молекулами мРНК, что делает обратную транскрипцию процессом, специфичным для мишени.

Одноэтапные и двухэтапные методы ПЦР с обратной транскрипцией

Одноэтапная ОТ-ПЦР. Синтез комплементарной ДНК и ПЦР проводят в одном реакционном сосуде в общем реакционном буфере. Ген-специфичные праймеры направляют синтез кДНК и амплификацию конкретной мишени. К основным преимуществам одностадийной реакции относятся минимальное обращение с образцами, сокращение времени лабораторного исследования и проведение реакций в закрытой пробирке, что снижает вероятность ошибок пипетирования и перекрестного загрязнения.

Качество образцов РНК влияют на эффективность одноэтапной ПЦР с обратной транскрипцией. Продукт синтеза кДНК нельзя сохранить после одностадийной ОТ-ПЦР, поэтому требуются дополнительные аликвоты исходного образца РНК для повторения реакций или оценки экспрессии других генов.

Двухэтапная ПЦР с обратной транскрипцией. В двухэтапной лабораторной технике с обратной транскрипцией синтез кДНК осуществляется с использованием случайных гексамеров, олиго-dT primer и/или ген-специфических праймеров, дающих смесь молекул комплементарной ДНК. Синтезированные таким образом кДНК амплифицируют с использованием специфических праймеров.

В двухстадийной технике с обратной транскрипцией кДНК синтезируется в одной реакции, а затем аликвоту комплементарной ДНК используют для последующего эксперимента. Это требует дополнительного шага с открытой пробиркой, большего количества манипуляций с пипеткой и более длительного практического времени, что может привести к большей изменчивости и риску загрязнения. Оставшуюся kDNK можно сохранить для использования в будущем или для количественного определения экспрессии нескольких генов из одного образца РНК / кДНК.

Область применения ОТ-ПЦР

Многие клинически важные вирусы имеют геномы, состоящие из РНК. ПЦР с обратной транскрипцией. Этот метод полезен для выявления таких вирусов. ОТ-ПЦР также используют с целью выявления вирусных причин менингита и менингоэнцефалита, и таких, как энтеровирусы. ПЦР с обратной транскрипцией применяется для выявления следующих вирусов:

  • вирус денге;
  • хантавирус;
  • метапневмовирус человека;
  • тяжелый острый респираторный синдром.

Количественные анализы ПЦР с обратной транскрипцией, как правило, используют при определении вирусной нагрузки ВИЧ и ВГС (количества этих вирусов, присутствующих в крови пациента).

Данные о вирусной нагрузке важны для мониторинга реакции отдельного пациента на терапию. Например, после соответствующей антиретровирусной терапии у пациента, инфицированного вирусом ВИЧ, должно наблюдаться увеличение количества CD4 и снижение вирусной нагрузки ВИЧ.

ОТ-ПЦР также возможно использовать для обнаружения других микроорганизмов (бактерий, паразитов и грибков) путем нацеливания на их рРНК. Этот подход лучше, чем обнаружение ДНК, так как наличие РНК скорее связано с наличием жизнеспособных организмов.

Обнаружение мРНК с помощью техники с обратной транскрипцией помогает изучать экспрессию генов как микроорганизмов, так и клеток – хозяев человека.

Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР — это вариант тестирования, в котором более одной целевой последовательности амплифицируют с использованием нескольких наборов праймеров в одной смеси. Этот процесс позволяет одновременно амплифицировать несколько сегментов гена, а не проводить отдельные тестовые прогоны для каждого ПЦР.

Мультиплексная техника — эффективный способ для генетических анализов, требующий многократного повторения, например, путем секвенирования. Она требует небольшого количества ДНК (10-200 нг) в качестве исходной матрицы, и его можно проводить на образцах с субоптимальным качеством дезоксирибонуклеиновой кислоты. Хотя мультиплексная техника имеет много преимуществ, ее оптимизация не менее сложна. При использовании нескольких пар primer праймеры из одной пары могут взаимодействовать с праймерами из другой. Поскольку к каждой паре праймеров могут предъявляться различные требования, единой оптимальной температуры плавления (Tm) и ΔG не существует.

Праймеры для мультиплексной ПЦР

При разработке праймеров (primer) для амплификации для мультиплексной ПЦР необходимо учитывать несколько факторов, в том числе;

  • длина праймеров – варьируется в пределах 18–25 нуклеотидов;
  • температура плавления — либо одинаковая, либо находится в пределах 1–2°С;
  • содержание GC в праймерах — соответствует (50–55%);
  • кросс – комплементарность — чтобы избежать интерференции, праймеры не имеют кросс-комплементарности.

Кроме того, следует избегать областей с повторяющимися последовательностями, известных как полиморфизмы одиночных нуклеотидов зародышевой линии (SNP), и областей с высокой степенью гомологии, поскольку они могут повлиять на эффективность амплификации и привести к систематической ошибке амплификации.

Преимущества мультиплексной ПЦР

Мультиплексная методика предлагает несколько выжнейших преимуществ, таких как:

  • Внутренний контроль амплификации обеспечивает точность отрицательных результатов в этом тестировании.

Во-первых, могут быть разработаны стратегии, включающие внутренний контроль проведения методики. Например, одна пара праймеров может быть направлена на последовательности, присутствующие во всех клинически значимых бактериях.

После проведения тестирования всегда должен обнаруживаться контрольный ампликон. Отсутствие контроля будет означать, что условия ПЦР не соблюдены, и тест необходимо будет повторить. При обнаружении контрольного ампликона отсутствие тестируемого ампликона можно с большей уверенностью интерпретировать как указание на отсутствие нуклеиновой кислоты — мишени в образце, а не на неисправность самой системы.

  • В одной реакции могут быть обнаружены многочисленные патогены, даже если эти патогены относятся к таксономически различным группам.

Еще одно преимущество мультиплексного лабораторного исследования — возможность поиска разных мишеней с помощью одного исследования. Пары праймеров, направленные на последовательности, специфичные для разных организмов или генов, можно комбинировать, чтобы свести к минимуму использование нескольких реакционных сосудов. Например, обнаружение вирусных агентов, вызывающих менингит или энцефалит (например, вирус простого герпеса, энтеровирус) с помощью мультиплексного ПЦР.

Область применения мультиплексной ПЦР

Мультиплексная ПЦР имеет множество применений. Метод успешно применяется во многих областях, таких как генотипирование, анализ мутаций и полиморфизмов, микросателлитный анализ STR, обнаружение патогенов или генетически модифицированных организмов и т. д.

В диагностических лабораториях мультиплексная ПЦР полезна для выявления различных микроорганизмов, вызывающих одни и те же типы заболеваний. Например:

  • обнаружение S. pneumoniae, H. influenzae и N. meningitidis (наиболее распространенных причин бактериального менингита) в образце ликвора;
  • выявление вирусных возбудителей менингита и менингоэнцефалита;
  • выявление и дифференциация полиомавирусов, поражающих человека;
  • обнаружение бактерий, вызывающих инфекцию среднего уха, пневмонию и т. д.

Реакции мультиплексной методики особенно полезны, когда количество возможных патогенов ограничено.

Недостатки мультиплексной ПЦР

Смешивание различных праймеров может вызвать некоторые помехи в процессе амплификации, особенно при увеличении количества используемых пар различных праймеров.

Секвенирование больших последовательных геномных областей с помощью мультиплексной техники может вызвать перекрестную реакцию между парами праймеров из-за перекрывания праймеров.

Вложенная ПЦР

Вложенная (гнездовая) ПЦР — это модификация ПЦР, предназначенная для повышения чувствительности и специфичности аналитической реакции. Метод включает использование двух наборов праймеров, направленных против одной и той же мишени, и двух последовательных реакций.

Первый набор праймеров предназначен для гибридизации с последовательностями выше второго набора primer, тогда как второй набор праймеров расположен внутри или вложен по отношению к первому набору праймеров. Первый набор праймеров, также называемый «внешним праймером», амплифицирует большой фрагмент гена, использующийся в качестве матрицы во втором цикле, нацеленном на меньшую область ампликона, с использованием второго набора праймеров, также известного как «внутренний праймер». или вложенные праймеры».

Традиционный подход к вложенной ПЦР заключался в проведении ряда циклов с использованием первого набора праймеров, а затем открытии реакционного сосуда и добавлении второго, вложенного набора праймеров для запуска второго цикла. Основной проблемой этого подхода считается загрязнение ампликона в лаборатории и последующая потеря специфичности анализа. Для решения этой проблемы были разработаны реакции вложенной ПЦР в одной пробирке, когда оба набора праймеров добавляются в исходный реакционный сосуд и проводится расширенная ПЦР.

Ампликоны из этих анализов визуализируют электрофорезом реакционной смеси в агарозном геле, окрашенном 2% бромистым этидием, вместе с маркером молекулярной массы.

Это лабораторное исследование иногда необходимо для компенсации неэффективности методики первого раунда из-за несовпадения праймеров, поэтому, если можно использовать хорошо подобранные праймеры для первого раунда, во многих случаях вложенный подход может не понадобиться.

Преимущества

Вложенная ПЦР уменьшает неспецифическую амплификацию целевой последовательности. Это связано с тем, что вложенные праймеры не находят область праймирования на каких-либо димерах праймеров, созданных в первичном исследовании. Вложенные праймеры будут праймировать только любой специфический продукт, полученный в первичном случае, таким образом поддерживая специфичность ПЦР.

Область применения вложенной ПЦР

Для повышения чувствительности анализа вложенная ПЦР используется во многих анализах. Это особенно полезно для субоптимальных образцов нуклеиновых кислот, таких как образцы, извлеченные из фиксированных формалином тканей, залитых парафином.

Вложенные ПЦР оказались полезными для обнаружения микроорганизмов, когда они присутствуют в очень малых количествах. Например:

  • обнаружение риккетсий (Rickettsia), бартонелл (Bartonella) и подобных организмов в крови (бактериемия) и тканях;
  • обнаружение герпесвируса и энтеровируса в ликворе;
  • обнаружение Mycobacterium tuberculosis в образце мокроты.

Недостатки метода

Основной недостаток: восприимчивость к загрязнению — чрезвычайная чувствительность вложенной ПЦР сопряжена со своим набором проблем. Этот тест очень чувствителен к загрязнению, так как требует больше времени для манипуляций с образцами. Загрязнение в основном происходит во время переноса продукта первого этапа во вторую пробирку для второго этапа амплификации.

Кроме того, к недостаткам теста можно отнести дороговизну. Этот анализ более дорогостоящий, поскольку он включает использование двух отдельных реакций для получения одного результата. Стоимость резко возрастет, если анализы будут повторяться при обнаружении загрязнения.

ПЦР с горячим запуском 

ПЦР с горячим запуском — это метод, уменьшающий неспецифическую амплификацию и обеспечивающий удобство проведения реакции при комнатной температуре. Полимеразы, используемые в технике с горячим запуском, неактивны при температурах окружающей среды. Активность полимеразы может ингибировать при этих температурах с помощью различных механизмов, включая взаимодействие антител, химическую модификацию и технологию аптамеров. При допустимых температурах реакции, достигнутых во время циклирования, полимераза диссоциирует от своего ингибитора и начинает полимеризацию.

Использование ДНК-полимераз с горячим запуском чаще всего рекомендуется для высокопроизводительных приложений, экспериментов, требующих высокой степени специфичности, или даже обычной методики, где требуется дополнительная безопасность, обеспечиваемая ферментом с горячим запуском.

Для реакций требуется несколько важных реагентов, в том числе матричная последовательность для амплификации, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), буферы и ДНК-полимераза Taq, чтобы ферментативно облегчить включение dNTP и, в конечном итоге, создать новые копии целевой последовательности.

Основной принцип методов и реагентов ПЦР с горячим стартом заключается в том, что они предназначены для ингибирования активности ДНК-полимеразы Hot Start Taq или включения модифицированных dNTP во время подготовки реакции до тех пор, пока не произойдет стадия тепловой активации. Существуют различные варианты остановки активности полимеразы горячего старта, в том числе химическая модификация, технология, опосредованная антителами, и технология, опосредованная аптамерами.

Каковы преимущества технологии горячего старта

  • предотвращает удлинение связывания праймеров с матричными последовательностями с низкой гомологией (ошибочный прайминг);
  • предотвращает удлинение связывания праймеров друг с другом (образование primer – димера) во время подготовки реакции;
  • повышает чувствительность и выход нужных фрагментов мишени.

Кроме того, технология позволяет настроить полимеразную цепную реакцию на высокопроизводительных или автоматизированных платформах для работы с жидкостями, поскольку реакции стабильны при комнатной температуре без ущерба для специфичности.

Продолжение статьи